Дополнительный материал к занятию.

Санитарная микробиология – раздел медицинской микробиологии, изучающей микрофлору окружающей среды и ее влияние на здоровье человека. Санитарная микробиология разрабатывает методы контроля за состоянием воды, почвы, воздуха, пищевых продуктов и различных предметов обихода. Одновременно санитарная микробиология разрабатывает микробиологические нормативы и мероприятия по оздоровлению окружающей среды.

Практическая санитарная микробиология использует 2 основных метода оценки санитарно-эпидемиологического состояния внешней среды: прямое обнаружение патогенных микроорганизмов и выявление косвенных признаков пребывания патогенов во внешней среде.

Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, как правило, затруднено из-за их малого количества и проводится по эпидпоказаниям. Косвенные методы – это определениеобщей микробной обсеменённости илиобщего микробного числа (ОМЧ), а также определение и титрованиесанитарно-показательных микроорганизмов (СПМ), которые регулярно проводятся контролирующими органами с целью определения безопасности объектов для здоровья населения.

ОМЧ расценивается как показатель интенсивности загрязнения окружающей среды органическими веществами.

Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов в окружающей среде.

Санитарно-показательные микроорганизмы
должны удовлетворять следующим характеристикам

1. Постоянно обитать в естественных полостях человека и животных и выделяться в окружающую среду.

2. Не должны размножаться вне организма, исключая пищевые продукты.

3. Длительность их выживания в окружающей среде должна быть не меньше и даже несколько больше, чем у патогенных микроорганизмов.

4. Устойчивость санитарно-показательных микроорганизмов в окружающей среде должна быть аналогичной или превышать таковую у патогенных микроорганизмов.

5. У санитарно-показательных микроорганизмов не должно быть в окружающей среде «двойников».

6. Микроб не должен изменяться в окружающей среде.

7. Методы индикации и идентификации санитарно-показательных микроорганизмов должны быть простыми.

(предусматривают определение общей микробной обсеменённости (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов).

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству особей, обнаруживаемых в 1 м 3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий: гемолитических стрептококков, золотистых стафилококков, а также дрожжевых и плесневых грибов.

Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсемененности разделена на 4 класса.

Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путем посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова).

Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их
функционального назначения и класса чистоты

Класс чистоты	Название помещений	Санитарно-микробиологические показатели
общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество колоний S.aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 дм 3 воздуха
До начала	Во время работы	До начала	Во время работы	До начала	Во время работы
Особо чистые(А)	Операционные, родильный зал, асептические боксы для гематологических, ожоговых больных, палата для недоношенных, асептический блок аптек, стерилизационные (чистая половина) боксы бактериологических лабораторий	не более200	не более500	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Чистые(Б)	Процедурные, перевязочные, предоперационные, палаты реанимации, залы реанимации, детские палаты, комнаты сбора и пастеризации грудного молока, ассистентские и фасовочные аптек, дистилляторная,помещения бактериологических и клинических лабораторий, предназначенные для исследований	не более500	не более750	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Условно чистые(В)	Палаты хирургических отделений; коридоры, примыкающие к операционным и родильным залам; смотровые, боксы и палаты инфекционных отделений, ординаторские, материальные, кладовые чистого белья	не более750	не более1000	не должно быть	не более2	не должно быть	не должно быть
Грязные (Г)	Коридоры и помещения административных зданий, лестницы, лечебно-диагностические, санитарные комнаты, туалеты, комнаты грязного белья	Не нормируются

Седиментационный метод (по Коху) – оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определённое время (5-10 минут на общую обсеменённость и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, маркируют и выдерживают 24 часа в термостате и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязнённости воздуха: по приблизительному подсчёту на площадь 100 см 2 в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Аспирационный метод – более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

ОМЧ	=	N ∙ 1000
V

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 - искомый объём воздуха, дм 3 .

Наличие санитарно-показательных для воздуха микроорганизмов – золотистого стафилококка, гемолитического стрептококка, плесневых грибов, кандид – определяют по характеру выросших колоний на специальных средах (желточно-солевом агаре, кровяном агаре, среде Сабуро) и при микроскопическом изучении бактерий из этих колоний.

Контрольные вопросы.

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Виды ферментов: по их действию; по выделению в окружающую среду; конститутивные и адаптивные ферменты. Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения протеолитической и сахаролитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это значит? Среды Гисса, их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, как производится посев и как отмечают на этой среде ферментативные свойства бактерий? Методы определения протеолитической активности бактерий: разжижение желатина, образование индола, сероводорода, аммиака. Что представляют собой микротестсистемы для определения ферментативной активности бактерий: как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ, как используется эта система, как производится посев и учёт результатов?Микрофлора воздуха: какие микробы чаще всего встречаются, как меняется микрофлора в зависимости от условий. Что такое микробное число воздуха, какими методами оно определяется? Что такое санитарно-показательные микроорганизмы? Какие микробы считаются санитарно-показательными для воздуха? Какие патогенные микробы могут передаваться через воздух?Определите понятия: нормальная микрофлора организма человека; постоянная микрофлора; транзиторные микроорганизмы; потенциально опасные микроорганизмы. Назовите органы и ткани, свободные от постоянной микрофлоры. Какие микробы относятся к постоянной микрофлоре полости рта и какое значение имеют в норме и патологии? Характеристика микрофлоры различных областей организма: полости рта, желудочно-кишечного тракта, органов дыхания. Значение нормальной микрофлоры - положительное и отрицательное. Что такое дисбактериоз, в чём он выражается, причины его возникновения и способы предупреждения и устранения. Назовите препараты, применяемые для устранения дисбактериоза, что они содержат, как применяются, что с ними происходит в организме человека.

Задание на самостоятельную работу.

1. Выпишите названия (по-латыни) видов санитарно-показательных микроорганизмов для воздуха.

2. Напишите названия препаратов, применяемых для устранения дисбактериоза, их состав, применение.

Работа студента на практическом занятии.

1. Выделение чистой культуры бактерий - окончание (3 день). Посмотрите свои посевы предыдущего занятия, приготовьте мазки, окрасьте по Граму в модификации Синёва, промикроскопируйте, сделайте вывод о чистоте выделенной культуры.

2. Изучение ферментативной активности бактерий. Учет результатов определения ферментативной активности бактерий на средах Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой и на среде Олькеницкого. (Демонстрация).

3. Ознакомьтесь с микро-тестсистемами, СИБ.

4. Приготовьте мазок из зубного налета: предметное стекло нанести бактериологической петлей каплю физиологического раствора. Стерильной заостренной деревянной палочкой возьмите у себя зубной налет, внесите в каплю. Приготовьте мазок после высушивания и фиксации окрасьте по Граму в модификации Синёва, микроскопируйте, зарисуйте. Сделайте вывод.

5.Исследование микрофлоры воздуха. Произведите посев воздуха в лаборатории седиментационным методоми с помощью аппарата Кротова.

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бакте-
рий – показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием санитарно-показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязнённые фекалиями человека или животных. Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее (до 2 недель), бактерий родов Citrobacter и Enterobacter – на несвежее (до 2 месяцев), а Clostridium perfringens – на давнее (более 2 месяцев) фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса – количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра – масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общего числа сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Микробиологические нормативы для оценки санитарного состояния почвы:

– чистая почва: коли-титр – 1 и выше; перфрингенс-титр – 0,01 и выше; ОМЧ – 100-1000;

– загрязнённая почва: коли-титр – 0,9-0,01; перфрингенс-титр – 0,009-0,0001; ОМЧ – 1000-100000;

– сильно загрязнённая почва: коли-титр – 0,009 и ниже; перфрингенс-титр – 0,00009 и ниже; ОМЧ – 10000-4000000.

Для определения ОМЧ почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 . Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.

Для определения коли-титра, перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера. Инкубируют при 43 0 С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная, проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие E. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объёму, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. После 48 часов инкубации при 43 0 С учитывают результаты по образованию черных колоний C. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (крупные грамположительные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды в первые 12 часов роста при 43 0 С).

Санитарно-микробиологическое состояние питьевой воды оценивается по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству мезофильных факультативно-анаэробных микроорганизмов (МЕФАМ) в 1 мл воды; присутствию общих и термотолерантных колиформных бактерий.

По эпидемиологическим показаниям, в воде дополнительно определяют наличие энтерококков, сальмонелл, шигелл, вибрионов, энтеровирусов.

Определение общего числа микроорганизмов

Общее микробное число (ОМЧ) - общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при t=37 0 С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Из каждой пробы воды делают посев не менее двух объёмов по 1 мл. Для этого 1 мл воды вносят в стерильную чашку Петри, заливают 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45-46 0 С питательного агара, тщательно перемешивают. После застывания агара чашки помещают вверх дном и инкубируют при 37 0 С в течение 24 часов. Затем подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на 2. Результат выражают в КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл исследованной пробы воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие споры палочки, не обладающие оксидазной активностью ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при 37 0 С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, но, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при 44 0 С в течение 24 часов.

(согласно СанПиНу 2.1.4.559–96)

Примечания: 1 – при определении проводится 2-кратное исследование по 100 мл отобранной пробы воды; 2 – превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водоразбора наружной и внутренней водопроводной сети в течение 12 месяцев, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год; 3 – определение проводится только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть; 4 – определение проводится только при оценке эффективности технологии обработки воды.

Метод мембранных фильтров

Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объёме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 0 С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нём колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 0 С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре.

Бродильный метод

Засевают 3 объёма воды по 100 мл (для качественного анализа) или при исследовании воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий делают посев 3 объёмов по 100 мл, 3 – по 10 мл и 3 – по 1 мл.

Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл воды – в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 37 0 C в течение 24-48 часов. Через 24 часа из питательной среды, где отмечено наличие роста и образование газа , делают высев по секторам на среду Эндо, приготовленную с добавлением фуксина.

Положительный результат на присутствие общих колиформных бактерий в данном объёме воды дают по помутнению и образованию газа на среде накопления (глюкозо-пептонная среда или лактозо-пептонная среда) и наличию красных колоний на среде Эндо. В сомнительных случаях выполняют оксидазный тест и подтверждают способность к газообразованию на среде с лактозой или маннитом (глюкозой).

Результат отрицательный , если

– в среде накопления нет признаков роста,

– на секторах среды Эндо нет роста лактозоположительных колоний,

– на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии,

– все колонии оказались оксидазоположительными,

– если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования.

Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий (общих и термотолерантных колиформных бактерий) – вычисляют по специальным таблицам.

Класс чистоты	Название помещений	Санитарно-микробиологические показатели
общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество колоний S.aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 дм 3 воздуха
До начала	Во время работы	До начала	Во время работы	До начала	Во время работы
Особо чистые (А)	Операционные, родильный зал, асептические боксы для гематологических, ожоговых больных, палата для недоношенных, асептический блок аптек, стерилизационные (чистая половина) боксы бактериологических лабораторий	не более 200	не более 500	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Чистые (Б)	Процедурные, перевязочные, предоперационные, палаты реанимации, залы реанимации, детские палаты, комнаты сбора и пастеризации грудного молока, ассистентские и фасовочные аптек, дистилляторная, помещения бактериологических и клинических лабораторий, предназначенные для исследований	не более 500	не более 750	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Условно чистые (В)	Палаты хирургических отделений; коридоры, примыкающие к операционным и родильным залам; смотровые, боксы и палаты инфекционных отделений, ординаторские, материальные, кладовые чистого белья	не более 750	не более 1000	не должно быть	не более 2	не должно быть	не должно быть
Грязные (Г)	Коридоры и помещения административных зданий, лестницы, лечебно-диагностические, санитарные комнаты, туалеты, комнаты грязного белья	Не нормируются

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

ОМЧ	=	N ∙ 1000
V

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 - искомый объём воздуха, дм 3 .

Контрольные вопросы

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Как регулируется продукция ферментов у бактерий? Какие группы ферментов различают в зависимости от механизма, которым регулируется продукция фермента? Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения сахаролитической и протеолитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это означает? Среды Гисса их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, её состав; как производится посев и как отмечают на этой среде ферментацию разных углеводов, образование сероводорода? Что представляют собой микротест-системы для определения ферментативной активности микробов; как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ; как используется эта система, как производится посев и учёт результатов? Укажите основные объекты внешней среды, которые подвергаются санитарно-бактериологическому исследованию. Микробиоценоз, определение понятия. Перечислите и дайте характеристику межвидовых взаимоотношений в микробиоценозах. Какие показатели определяются при бактериологической оценке объектов внешней среды? Санитарно-показательные микроорганизмы: определение понятия. Какими свойствами должны обладать санитарно-показательные микроорганизмы? Перечислите санитарно-показательные микроорганизмы для воздуха, воды, почвы. Микрофлора воды: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воды. Методика определения общего микробного числа воды. Показатели фекального загрязнения воды, методы их определения. Укажите предельно допустимые показатели для питьевой воды. Микрофлора воздуха: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воздуха, методы их определения. Микрофлора почвы: постоянная микрофлора, её значение для круговорота веществ в природе. Источники загрязнения почвы патогенными микроорганизмами. Показатели для санитарно-бактериологической оценки. Для каких заболеваний факторами передачи могут быть вода, воздух, почва? Некультивируемые формы бактерий: определение понятия, практическое значение.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Выпишите названия (по-латыни) видов санитарно-показательных микроорганизмов для воды, воздуха и почвы.

Самостоятельная работа студента на практическом занятии

1. Выделение чистой культуры бактерий–аэробов (3-й день). Изучите культуру на скошенном агаре макроскопически, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте, сделайте вывод о чистоте культуры. Для дальнейшей идентификации выделенной культуры произведите посев на среды «пёстрого» ряда и на среду Олькеницкого. Изучите готовые посевы аэробных бактерий на средах «пёстрого» ряда и на среде Олькеницкого, составьте таблицу «Биохимическая активность микроорганизмов». Ознакомьтесь с методикой изучения ферментативной активности бактерий с помощью микротест-систем и СИБ.

2. Выделение чистой культуры анаэробов (4–й день). Изучите характер роста культуры на среде Китта–Тароцци, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте.

3. Исследование микрофлоры воды и воздуха. Произведите посев водопроводной воды для определения общего микробного числа (ОМЧ). Определите показатели фекального загрязнения воды (наличие колиформных бактерий) по демонстрационным посевам и по таблице. Произведите посев воздуха лаборатории седиментационным методом и с помощью аппарата Кротова.

4. Методы изучения нормальной микрофлоры организма человека (подготовка к следующему занятию). Возьмите стерильным тампоном слизь из зева друг у друга и сделайте посев в пробирку с сахарным мясо-пептонным бульоном. Сделайте посев с кожи рук на чашку с МПА: возьмите маленький стерильный ватный тампон, смочите его в стерильном физиологическом растворе, протрите кожу, сделайте посев этим тампоном.

Современная санитарная микробиология стремится использовать простые, точные и надежные методы. Эти методы направлены на определение общей микробной загрязненности, выявления СПМ и включают: прямой подсчет при микроскопировании микроорганизмов в объекте; методы выделения и идентификации микроорганизмов; биологические методы с использованием лабораторных животных.

Прямой подсчет применяют в экстренных случаях при необходимости срочного ответа о количественном содержании бактерий (например, при авариях в системе водоснабжения, при оценке эффективности работы очистных сооружений и др.). Основной недостаток– невозможность получить точный ответ из-за образования бактериями агломератов или прикрепления к частицам среды. Метод не позволяет отличать живые бактерии от погибших.

Посев на питательные среды проводят для количественного подсчета. На плотных питательных средах подсчитывают число выросших колоний. При этом исходят из предположения, что каждая колония является результатом попадания на среду одной жизнеспособной клетки.

Данный метод неточен, так как выявляет только группы микроорганизмов, растущих на определенных питательных средах при определенной температуре. Невозможно создать унифицированную, подходящую для всех микроорганизмов среду. Не все микроорганизмы, находящиеся в объекте, дают колонии на питательной среде из-за конкуренции и антагонизма.

Содержание числа живых клеток в объекте отражает показатель количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), которое определяется путем подсчета колоний, выросших в агаризованной среде в чашках Петри при температуре (30±1) 0 С в течение (72±3) часов. Это определение регламентировано Международной организацией по стандартизации методов микробиологического анализа (International Standart Organisation, ISO) и ГОСТ 10444.15-94. КМАФАнМ выражается в колониеобразующих единицах (КОЕ) и рассчитывается на 1 г или 1 см 3 образца.

Термин КМАФАнМКОЕ/г (см 3) наиболее полно характеризует определяемую принятыми методами группу микроорганизмов, поэтому в настоящее его используют вместо обозначений, применявшихся ранее (общее количество бактерий, количество сапрофитов, гетеротрофов) в 1 г (см 3), общее микробное число).

Микробиологические показатели безопасности пищевых продуктов для большинства групп микроорганизмов оценивают по альтернативному признаку , т.е. нормируется масса продукта, в которой не допускается присутствие определенных видов микроорганизмов.

Для количественного учета СПМ применяют также две группы методик – определение индекса и титра.

Индекс – количество особей санитарно-показательных микроорганизмов, обнаруженных в определенном объеме или количестве исследуемого объекта (для воды в 1 дм 3 , для почвы, донных отложений и др. – в 1 г).

Титр – это тот наименьший объем исследуемого материала в см 3 или массовое количество в граммах, в котором обнаружена хотя бы одна особь санитарно-показательного организма.

Индекс – величина обратная титру, и наоборот титр – величина обратная индексу.

Микрофлора окружающей среды

Микрофлора воды

Вода является естественной средой обитания разнообразных микроорганизмов. В воде рек, открытых водоемов, морей, океанов обнаруживаются представители всех таксономических групп микроорганизмов – бактерии, вирусы, грибы, простейшие, водоросли. Совокупность всех микроорганизмов, населяющих водоемы, называется микробиальным планктоном.

Микрофлора природных вод в значительной степени зависит от их происхождения. Различают воды: пресные поверхностные – проточные (воды рек, ручьев) и стоячие (воды озер, прудов, водохранилищ); подземные – почвенные, грунтовые, артезианские; атмосферные – дождь, снег; морские . По характеру использования различают воду питьевую (она бывает централизованного водоснабжения и местного, при котором забор ведется из открытых водоемов или подземных источников), воду плавательных бассейнов, лёд хозяйственный. Особого внимания с санитарной точки зрения требуют сточные воды – хозяйственно-фекальные, промышленные, смешанные (хозяйственно-фекальные и промышленные), талые и ливневые, микрофлора которых загрязняет природные воды. С экологической точки зрения всю микрофлору водоемов можно разделить на две группы – автохтонную и аллохтонную.

Автохтонная микрофлора – это микроорганизмы, живущие и размножающиеся в воде. Состав автохтонной микрофлоры незагрязненных водоемов относительно стабилен и характерен для каждого отдельного водоема. Для морей и соленых озер типична галофильная микрофлора, горячих источников – термофильная, северных водоемов – психрофильная. Микробное население воды также отражает состав микрофлоры почвы, с которой вода непосредственно соприкасается. Автохтонная микрофлора играет значительную роль в круговороте веществ в природе, в процессах самоочищения водоемов и поддержания их биологического равновесия.

Аллохтонная микрофлора – это микроорганизмы, приносимые с различными загрязнениями. Среди них встречаются как представители нормальной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, так и возбудители различных болезней. Условия водоемов не являются благоприятной средой для размножения аллохтонных микроорганизмов, поэтому они через определенное время отмирают.

Взаимоотношения между автохтонной и аллохтонной микрофлорой в значительной мере определяют эффективность освобождения водоемов от загрязнения их органическими субстратами и патогенными микроорганизмами, т.е. самоочищение водоемов.

Сапробность (гр.sapros – гнилой) – степень загрязнения водоемов органическими веществами. По шкале сапробности различают три зоны – полисапробные, мезосапробные и олигосапробные. Шкала сапробности была предложена в 1908 г. Кольквитцем и Марссоном.

Полисапробные зоны (зоны сильного загрязнения) содержат большое количество органических веществ, которые легко разлагаются и поэтому усваиваются микроорганизмами. В этих зонах почти полностью отсутствует кислород. Микробное население особенно обильно, но число видов ограничено. Микроорганизмы представлены преимущественно анаэробными бактериями, а также грибами и актиномицетами, вызывающими процессы гниения и брожения. Под влиянием этих микроорганизмов сложные органические соединения распадаются на простые с образованием аммиака, сероводорода, диоксида углерода, метана, индола, скатола и др. Число бактерий в 1 см 3 воды в этой зоне достигает миллиона и более. Преимущественно обнаруживаются палочковидные бактерии (до 80% и более).

Мезосапробные зоны (зоны умеренного загрязнения) характеризуются преобладанием окислительных процессов, нитрификацией. Азотсодержащие соединения распадаются до аммиака, который окисляется до нитритов и нитратов. Общее количество микроорганизмов также велико – сотни тысяч в 1 см 3 воды. Качественный состав микрофлоры разнообразен. В основном это нитрифицирующие бактерии, являющиеся облигатными аэробами. Не менее важным является участие водных микроорганизмов в минерализации углеводсодержащих соединений – целлюлозы, лигнина и др. К этим микроорганизмам относятся аэробные и факультативно-анаэробные бактерии родов Pseudomonas, Mycobacterium, Flavobacterium , грибы родов Streptomyces, Candida и другие, а также анаэробные бактерии рода Clostridium .

Олигосапробные зоны (зоны чистой воды) характеризуются окончанием процесса самоочищения и небольшим количеством органических веществ. Минерализация органического вещества заканчивается. Видовой состав микрофлоры приближается к обычной автохтонной флоре. Количество микроорганизмов в 1 см 3 воды исчисляется десятками, реже сотнями. В чистых водах преобладают кокки (до 80% и более).

Процессы самоочищения воды в водоемах происходят последовательно и непрерывно, характеризуясь постепенной сменой биоценозов. На процессы самоочищения влияет целый ряд факторов: разбавление загрязненных вод чистыми, прозрачность воды, температура, оседание загрязненных частиц, наличие химических веществ, симбиотические и антагонистические взаимоотношения в водных биоценозах.

Микрофлора почвы

Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов в природе. Почва формируется на разрушающихся под действием климатических условий горных породах при участии органических соединений, образуемых в результате разложения растительных и животных организмов. Почвенные микроорганизмы принимают активное участие в процессах формирования и самоочищения почвы, а также в круговороте веществ в природе.

Количественный состав микрофлоры почвы зависит от ее структуры, содержания органических и минеральных соединений, а также влажности, кислотности, аэрации, температуры и других факторов. Число микроорганизмов в 1 г почвы может достигать нескольких миллиардов. Больше всего их находится в унавоженной, подвергающейся обработке почве, меньше – в песках. Количество микроорганизмов подвержено сезонным колебаниям – весной микробное население увеличивается, достигая максимума к лету, в разгар лета уменьшается (в результате наиболее активного воздействия солнечных лучей) осенью опять увеличивается, и снижается зимой. Распределение микроорганизмов по глубине также неравномерно. На поверхности в слое толщиной 1-2 мм относительно мало микроорганизмов из-за влияния ультрафиолетового облучения. Наиболее обильна микрофлора в слое на глубине 10-20 см, где протекают основные биохимические процессы. В более глубоких почвенных слоях микрофлора становится более скудной, и на глубине 4-5 м обнаруживается уже очень мало микроорганизмов.

Качественный состав микрофлоры почвы очень разнообразен. В составе микрофлоры почвы можно выделить различные физиологические группы микроорганизмов, которые участвуют в различных процессах на разных этапах постепенного разложения органических веществ. 1) Микроорганизмы-аммонификаторы, которые вызывают гниение остатков растений, трупов животных, разложение мочевины. 2) Нитрифицирующие бактерии, которые обладают способностью окислять аммиак до азотистой кислоты, образуя нитриты. 3) Микроорганизмы, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды брожений. 5) Бактерии, участвующие в круговороте серы, фосфора, серы и других элементов.

С выделениями человека и животных, с различными хозяйственно-бытовыми и промышленными стоками в почву попадает громадное количество разнообразных микроорганизмов, в том числе и патогенных. Среди патогенных микроорганизмов можно выделить три группы. 1) патогенные микроорганизмы, постоянно обитающие в почве. К ним относится небольшое количество микроорганизмов. Особого внимания среди них заслуживают клостридии ботулизма, которые попадают в почву с испражнениями человека и животных, образуют споры, остаются в почве долгое время. 2) Спорообразующие патогенные микроорганизмы (бациллы сибирской язвы, клостридии столбняка и газовой гангрены), для которых почва является вторичным резервуаром. При благоприятных условиях эти микроорганизмы могут размножаться в почве и сохраняться в виде спор длительное время. 3) Патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с выделениями человека и животных, сохраняющиеся в ней в течение нескольких недель или месяцев. Эти микроорганизмы (сальмонеллы, шигеллы, вибрионы, микобактерии, лептоспиры, бруцеллы и др.) не образуют спор и поэтому быстро гибнут в результате воздействия различных физических и биологических факторов.

Естественные биохимические процессы, происходящие под воздействием микроорганизмов, обуславливают самоочищение и обезвреживание почвы. При правильном управлении такими процессами опасность передачи инфекционных болезней через почву может быть сведена к минимуму.

Микрофлора воздуха

Воздух не является естественной средой обитания микроорганизмов, но играет большую роль в их распространении. Микроорганизмы попадают в воздух из почвы, воды, из организма человека и различных животных. В большинстве случаев эти микроорганизмы не способны размножаться в связи с отсутствием питательных веществ и недостатком влаги.

Источником загрязнения атмосферного воздуха микроорганизмами является в основном почва. На микрофлору атмосферного воздуха оказывают влияние солнечные лучи, колебания температуры, скорость ветра, атмосферные осадки, наличие зеленых насаждений. Микрофлора атмосферного воздуха преимущественно сапрофитная. В атмосферном воздухе микроорганизмов больше летом (особенно в сухую погоду) и меньше зимой.

Обсемененность микроорганизмами воздуха закрытых помещений всегда превышает обсемененность атмосферного воздуха. Это касается также патогенной микрофлоры, которая может попадать от больных людей, животных и микробоносителей. В закрытых помещениях микрофлора воздуха более обильна зимой, что связано с меньшей возможностью проветривания. Контаминация воздуха микроорганизмами происходит в основном капельным путем – при разговоре, кашле, чиханье. Возможно также попадание микроорганизмов со слущиваюшимся эпидермисом кожных покровов, с пылью загрязненных объектов.

В основе воздушно-капельного и воздушно-пылевого механизма передачи инфекционных болезней лежит теория аэрозоля. Аэрозоль представляет собой коллоидную систему, состоящую из воздуха, капелек жидкости или частиц твердого вещества, включающих значительное количество микроорганизмов. Такой аэрозоль выделяет каждый человек или животное при дыхании, кашле и т.п. Размер капелек аэрозоля может быть различным – от 10-100 до 2000 нм. В зависимости от размера капелей, их электрического заряда, скорости движения в воздухе различают капельную, пылевую фазы аэрозоля и капельные ядрышки. Капельная фаза аэрозоля характеризуется присутствием в воздухе мелких капель, длительно в нем удерживающихся и высыхающих прежде, чем они успевают осесть. Крупные капли аэрозоля быстро оседают под действием силы тяжести и высыхают, образуя пыль, которая при определенных условиях поднимается в воздушную среду – это пылевая фаза аэрозоля. Мелкие капельки аэрозоля (до 100 нм) высыхая, остаются в воздухе во взвешенном состоянии и образуют устойчивую аэродисперсную систему – капельные ядрышки , которые могут переноситься на значительные расстояния. В капельных ядрышках частично сохраняется влага, что обуславливает жизнеспособность в них микроорганизмов. Наибольшую опасность для здоровья представляют микроорганизмы в мелких частицах (до 100 нм), которые способны проникать глубоко в альвеолы легких, преодолевая защитные барьеры верхних дыхательных путей.

Пищевые заболевания

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И

СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

Санитарная микробиология

Учебное пособие

Для студентов медицинских вузов

Казань 2011

УДК 579.63:614.(075.8)

ББК 51.201.7я73

Печатается по решению Центрального координационно-методического совета Казанского государственного медицинского университета

Составители - сотрудники кафедры микробиологии:

профессор О.К.Поздеев, профессор Л.Т.Мусина, доцент А.Н.Савинова,

доцент Е.Р.Федорова, доцент Г.Ш.Исаева, ст. преподаватель С.Б.Богданова,

ассистент Ю.В.Валеева

Рецензенты:

Доцент кафедры микробиологии Казанской государственной медицинской

академии к.б.н. Л.В. Кипенская

Доцент кафедры эпидемиологии Казанского государственного медицинского университета к.м.н. Н.М. Хакимов

Санитарная микробиология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов/ О.К.Поздеев, Л.Т.Мусина, А.Н.Савинова, Е.Р.Федорова, Г.Ш.Исаева, С.Б.Богданова, Ю.В.Валеева - Казань: КГМУ, 2011 - 101 с.

Учебное пособие предназначено студентам медицинских вузов для самостоятельного изучения основных разделов санитарной микробиологии. Пособие составлено в соответствии с официально утвержденными программами преподавания микробиологии в медицинских вузах и документами, регламентирующими исследования по санитарной микробиологии. В пособии учтены современные нормативные документы по исследованию воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и ЛПО. Пособие содержит методики санитарно-микробиологического контроля различных объектов, цели и задачи лабораторных занятий, направленных на освоение общекультурных и профессиональных компетенций, учебные карты занятий, вопросы для самоподготовки и самоконтроля, ситуационные задачи и тесты.

Казанский государственный медицинский университет, 2011

1. Список сокращений…………………………………………………………… 4

2. Вводные представления…………………………………………………………5

3. Микрофлора воды………………………………………………………………..9

4. Санитарно-микробиологическое исследование питьевой воды централизованного водоснабжения………………………………….…………11

5. Выявление Legionella pneumophila в объектах окружающей среды………...17

6. Микрофлора воздуха……………………………………………………………..23

7. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха в

лечебно-профилактических организациях (ЛПО)……………...……………...25

8. Микрофлора почвы………………………………………………………………30

9. Санитарно-микробиологическое исследование почвы………………………..32

10. Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов………...39

11. Основные методы определения санитарно-показательных микробов в

пищевых продуктах ………………………………………………………………40

12. Микрофлора молока и молочных продуктов……………………………………41

13. Микрофлора мяса и мясных продуктов………………………………………….47

14. Исследование мяса……………………………………………………………...... 47

15. Санитарно-микробиологическое исследование полуфабрикатов и готовых

изделий из рубленого мяса………………………………………………………..49

16. Санитарно-микробиологическое исследование колбасных изделий и

продуктов из мяса…………………………………………………………………49

17. Санитарно-микробиологическое исследование рыбы…………………………50

18. Санитарно-микробиологическое исследование напитков……………………..51

19. Санитарно-микробиологическое исследование консервов……………………52

20. Санитарно-микробиологические исследования в лечебно-профилактических

организациях (ЛПО)……………………………………………..……………..…58

21. Санитарно-микробиологические исследования в стационарах

(отделениях) хирургического профиля………….……………………………….58

22. Санитарно-микробиологические исследования в стационарах (отделениях)

акушерского профиля и перинатальных центров………………………………59

23. Санитарно-микробиологические требования к стоматологическим

медицинским организациям……………………………………………………..60

24. Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и

эксплуатации фельдшерско-акушерских пунктов (ФАП)……………………..61

25. Лабораторные исследования в ЛПО…………………………………………….61

26. Микробиологический контроль аптек…………………………………………..67

27. Тесты по санитарной микробиологии…………………………………………..83

28. Список литературы……………………………………………………………….100

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БГКП - бактерии группы кишечной палочки

БОЕ - бляшкообразующие единицы

ГОБ - грамотрицательные бактерии

ГОСТ - государственный стандарт

ГПС - глюкозо-пептонная среда

ЖСА - желточно-солевой агар

ЖСТ - желточная среда Турчинского

КМАФАМ - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных

микроорганизмов

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛПО - лечебно-профилактические организации

ЛПС - лактозо-пептонная среда

МАФАМ - мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные

микроорганизмы

МАФАнМ - мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные

микроорганизмы

МЖСА - молочно-желточно-солевой агар

МИС - молочно-ингибиторная среда

МКТ - Мюллера-Кауфмана тетратионатный бульон

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

МСА - молочно-солевой агар

МУК - методические указания

ОКБ - общие колиформные бактерии

ОМЧ - общее микробное число

ПБЛ - питательный бульон для листерий

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

СанПиН - санитарные правила и нормативы

СП - санитарные правила

СПМ - санитарно-показательные микроорганизмы

ТКБ - термотолерантные колиформные бактерии

ТР - технический регламент

УФ - ультрафиолетовые лучи

ЦРБ - Центральная районная больница

ЩЭС - щелочная элективная среда с полимиксином

XLD - ксилоза-лизин декстрозный агар

RVS - среда Раппопорта-Вессилиадиса с соей

ВВОДНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ

Санитарная микробиология - направление медицинской микробиологии, изучающее микрофлору окружающей среды и её влияние на здоровье человека и состояние среды его обитания. Началом развития санитарной микробиологии можно считать 1883 г., когда французский врач Э. Масе предложил рассматривать кишечную палочку как показатель фекального загрязнения воды. Изучение микрофлоры и микробиологических процессов в среде обитания человека необходимо для гигиенической оценки его взаимоотношений с окружающей средой.

Знания, умения и навыки, полученные при изучении санитарной микробиологии, способствуют выработке таких общекультурных и профессиональных компетенций, как:

1. Способность и готовность анализировать социально-значимые проблемы и процессы, использовать на практике методы гуманитарных, естественнонаучных, медико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности (ОК -1)

3. Способность и готовность применять методы асептики и антисептики, использовать медицинский инструментарий, проводить санитарную обработку лечебных и диагностических помещений медицинских организаций (ПК-7).

4.Способность и готовность использовать нормативную документацию, принятую в здравоохранении (законы Российской Федерации, технические регламенты, международные и национальные стандарты, приказы, рекомендации, терминологию, международные системы единиц (СИ), действующие международные классификации), а также документацию для оценки качества и эффективности работы медицинских организаций (ПК-27).

Основные задачи санитарной микробиологии:

1. Изучение микробных биоценозов во внешней среде

2. Обнаружение во внешней среде патогенных микробов или их токсинов.

3. Обнаружение во внешней среде условно-патогенных микроорганизмов, являющихся косвенными показателями загрязнения изучаемых объектов патогенными микробами.

4. Выявление во внешней среде микроорганизмов, являющихся причиной порчи пищевых продуктов, сырья, строительных материалов.

5. Выработка нормативов, характеризующих гигиеническое состояние объектов внешней среды.

Санитарно – микробиологические исследования проводят:

1. При проведении текущего санитарного надзора

2. При решении вопросов о возможных источниках и путях передачи возбудителей инфекционных заболеваний.

3. При проектировании и выборе места для строительства зданий, населенных пунктов и сельскохозяйственных объектов.

4. При решении вопросов водоснабжения, канализации и обеззараживания отбросов.

Стандартные методы санитарно-микробиологических исследований регламентированы ГОСТами, санитарными правилами (СП), санитарными правилами и нормами (СанПиН) и методическими указаниями (МУК) и техническими регламентами (ТР).

Принципы проведения санитарно-микробиологических исследований.

1. Пробы для исследований следует отбирать с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта. Исследования необходимо проводить быстро; при невозможности немедленного проведения анализа материал сохраняют в холодильнике не дольше 6-8 часов.

2. Для получения объективных результатов следует отбирать несколько проб из разных участков объекта.

3. Более адекватные результаты можно получить проведением повторных отборов и анализов проб.

4. При проведении анализов следует использовать только стандартные и унифицированные методы исследования.

5. Интерпретацию результатов санитарно-микробиологических исследований следует проводить с учетом других гигиенических показателей (органолептических, химических, физических).

Применяют 2 основных метода оценки санитарно-гигиенического состояния внешней среды:

1. Прямое обнаружение патогенных микроорганизмов

2. Появление косвенных признаков пребывания патогенных микроорганизмов во внешней среде.

Методы косвенной индикации применяют чаще.

При проведении исследований используют два критерия, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии возбудителя во внешней среде: общее микробное число (ОМЧ ) и содержание санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ ).

ОМЧ определяют путем подсчета всех микроорганизмов (растущих на питательных средах) в 1 г или 1 мл субстрата.

Санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ ) - условно-патогенные микробы, являющиеся облигатными представителями нормальной микрофлоры человека и животных, обнаружение которых во внешней среде свидетельствует о фекальном или воздушно-капельном загрязнении ее выделениями человека.

Основные характеристики СПМ.

1. СПМ должны постоянно обитать в естественных полостях человека и животных и постоянно выделяться во внешнюю среду.

2. СПМ не должны размножаться во внешней среде (исключая пищевые продукты)

3. Длительность выживания СПМ должна быть несколько больше, чем у патогенных микроорганизмов.

4. Устойчивость СПМ во внешней среде должна быть не меньше, чем у патогенных микроорганизмов.

5. У СПМ не должно быть во внешней среде аналогов, с которыми их можно перепутать.

6. СПМ не должны изменяться во внешней среде.

7. Методы идентификации СПМ должны быть простыми.

1. Прямой подсчет числа бактерий с помощью специальных камер счетчиков.

2. Посев на питательные среды.

Титр СПМ - наименьший объем исследуемого материала или минимальное количество субстрата, в котором обнаружена хотя бы одна особь СПМ.

Индекс СПМ - количество особей СПМ, обнаруженных в определенном объеме или определенном количестве исследуемого материала

Перевод индекса в титр и обратно производится делением 1000 на число выражающее индекс, или 1000 на число, обозначающее титр.

НВЧ (наиболее вероятное число) - вероятная оценка числа СПМ в определенном объеме воды или в определенном объеме другого субстрата. Этот показатель имеет доверительные интервалы, в пределах которых может колебаться с вероятностью 95%.

Все СПМ расценивают как индикаторы биологического загрязнения.

Группа А - индикаторы фекального загрязнения - включает обитателей кишечника человека и животных. Это бактерии группы кишечной палочки (БГКП)- эшерихии, сальмонеллы, цитробактерии. Группа А включает также энтерококки, протей, сульфитвосстанавливающие клостридии (Clostridium рerfringens и др.), термофилы, бактериофаги, бактероиды, синегнойную палочку, кандиды и аэромонады.

Группа В - индикаторы орального загрязнения. Включает обитателей верхних дыхательных путей и носоглотки. Это зеленящие α и β-гемолитические стрептококки, стафилококки (гемолизирующие, плазмокоагулирующие, лецитиназа-положительные и антибиотикоустойчивые), в некоторых случаях также определяют вид золотистого стафилококка.

Группа С - индикаторы процессов самоочищения – сапрофитические микроорганизмы, обитающие во внешней среде. К ним относят бактерии-протеолиты, бактерии-аммонификаторы и нитрификаторы, некоторые спорообразующие бактерии, грибы, актиномицеты, целлюлозобактерии, бделловибрионы и сине-зеленые водоросли.

К основным СПМ относят БГКП, энтерококки, протеи, сальмонеллы, Clostridium perfringens , термофильные бактерии и бактериофаги энтеробактерий (колифаги).

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Модуль 1. Предмет и задачи санитарной микробиологии

микробиология исследование санитарный пищевой

1.1 Предмет и задачи санитарной микробиологии

Cанитарная микробиология - наука, изучающая микроорганизмы окружающей среды (в том числе патогенные бактерии и вирусы) и вызываемые их жизнедеятельностью процессы, которые непосредственно или косвенно могут оказать неблагоприятное влияние на здоровье людей и окружающую среду с целью гигиенической оценки взаимоотношений человека со средой его обитания.

Задачи санитарной микробиологии:

1. Разработка, совершенствование, оценка микробиологических методов исследования объектов окружающей среды (воды, воздуха, почвы пищевых продуктов и предметов обихода), методов контроля их санитарного состояния;

2. Оценка путей воздействия человека и животных на окружающую среду (стр.10). Особенно актуальное направление, поскольку связано с урбанизацией, развитием промышленности, загрязнением окружающей среды;

3. Разработка ГОСТов и других нормативов, методических указаний, определяющих соответствие микрофлоры окружающей среды гигиеническим требованиям, включая микробиологические показатели. При этом нормативы должны быть согласованы с общегигиеническими требованиями, поскольку микроорганизмы (бактерии, вирусы, грибы) находятся в единстве с факторами окружающей среды;

5. Проведение предупредительного (при проектировании и строительстве детских учреждений, больниц, населенных пунктов, источников водоснабжения) и текущего санитарного надзора (постоянный контроль за качеством водоснабжения, работой пищевой и торговой сети, обеззараживанием сточных вод и отбросов);

6. Охрана окружающей среды (гигиена окружающей среды) - изучение закономерностей взаимодействия человека с факторами окружающей среды и разработка научно-обоснованных рекомендаций по сохранению здоровья человека.

1.2 Принципы и методы санитарно-микробиологических исследований

Принципы, которыми руководствуются при санитарно-микробиологических исследованиях, исходят из основной задачи, разрешаемой ими: определение возможности присутствия в исследуемом объекте патогенных микроорганизмов или токсинов, образующихся в результате жизнедеятельности; обнаружение и оценка степени порчи изучаемого объекта (особенно пищевых продуктов).

Первым принципом является правильное взятие проб для санитарно-микробиологических исследований с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта, правил стерильности.

Второй принцип - проведение серийных анализов. Серию проб берут из разных участков исследуемого объекта, что позволит получить более достоверную характеристику объекта. Доставленные в лабораторию пробы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала - среднее по отношению к исследуемому материалу в целом.

Третий принцип - повторное взятие проб (получение сопоставимых результатов).

Четвертый принцип - применение стандартных и унифицированных методов исследования, утвержденных соответствующими ГОСТами и инструкциями. Это позволяет в различных лабораториях получать сравнимые результаты.

Пятый принцип - одновременное использование комплекса тестов при оценке исследуемых объектов для получения разносторонней санитарно-микробиологической характеристики.

Шестой принцип - проведении оценки исследуемых объектов по совокупности полученных результатов, полученных при использовании санитарно-микробиологических тестов с учетом других гигиенических показателей, указанных в соответствующих ГОСТах и нормативах (органолептических, химических, физических и т. д.).

Седьмой принцип - ответственность сотрудников санитарной службы за точность обоснования выводов и заключений о состоянии исследуемых объектов.

Для большей объективности оценки получаемых результатов врачи пользуются специальными инструкциями, нормативами, ГОСТами, разработанными профильными санитарно-микробиологическими учреждениями и утвержденными Министерством здравоохранения и социального развития РФ. Эти стандарты периодически пересматриваются и приводятся в соответствие с изменениями, которые вытекают из практического опыта, материальных возможностей, современного уровня знаний и развития техники.

Методы санитарно-микробиологических исследований

Санитарная микробиология при индикации и идентификации санитарно-показательных, патогенных микроорганизмов, при определении общей микробной обсемененности объектов окружающей среды использует методы, которые применяются в диагностических микробиологических лабораториях:

Микроскопической (при индикации и прямом подсчете микроорганизмов в исследуемом объекте);

Бактериологический - выделение микроорганизмов и их идентификация;

Биологический - заражение чувствительных животных;

Ускоренные (инструментальные) методы (реакция иммунофлюоресценции, радиоизотопный метод и др.).

Комплекс тестов, используемых для разносторонней и полноценной санитарно-микробиологической характеристики объектов окружающей среды:

Определение количества аэробных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ);

Определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов;

Индикация в исследуемых объектах патогенных микроорганизмов и их токсинов;

Определение степени микробной порчи изучаемых объектов или продуктов.

Существует два метода определения КМАФАнМ:

Метод прямого подсчета (в счетных камерах Горяева или в камерах, для счета бактерий, на мембранных фильтрах, через которые пропускают исследуемую жидкость или взвесь);

Метод количественного посева различных разведений образцов и проб исследуемого объекта на плотные питательные.

Выявляются лишь мезофильные, аэробные или факультативно-анаэробные бактерии.

Оба метода являются относительными, приблизительными. Для получения сравнимых результатов определение общего микробного числа исследуемых объектов проводится по стандартным, конкретным для каждого случая методикам, регламентированным соответствующими ГОСТами.

Модуль 2. Санитарно-показательные микроорганизмы

2.1 Учение о санитарно-показательных микроорганизмах

Основными источниками распространения большинства инфекционных болезней, поражающих человечество, являются люди и животные.

Непосредственное обнаружение возбудителей инфекционных болезней в объектах окружающей среды имеет ряд трудностей:

патогенные микроорганизмы в окружающей среде находятся непостоянно (как правило, в период эпидемий, а санитарные микробиологи, исходя из своих задач, работают в межэпидемические);

количество патогенных микроорганизмов, попавших в окружающую среду значительно уступает непатогенным и распространение их в среде неравномерно, поэтому первые страдают от конкуренции с сапрофитными, следовательно, отрицательные результаты определения патогенных м.о. в окружающей среде еще не свидетельствуют об их отсутствии

К оценке различных объектов подходят непрямым путем:

нормальная микрофлора тела человека и животных является качественно постоянной и мало изменяется при инфекционных заболеваниях. Для многих этих м.о. полость рта или кишечник являются биотопом (единственной природной средой обитания).

Находки таких микробов вне организма есть свидетельство о загрязнении соответствующими выделениями.

Следовательно, можно заключить о наличии фекального загрязнения и возможном присутствии кишечных инфекций или о попадании слизи из дыхательных путей и присутствии инфекций, передающихся воздушно-капельным путем.

Выделяемые в этих случаях микроорганизмы служат показателями санитарного неблагополучия (потенциальной опасности) исследуемых объектов и называются санитарно-показательными.

2.2 Требования к санитарно-показательным микроорганизмам

должны постоянно содержаться в выделениях человека и теплокровных животных и поступать в больших количествах в окружающую среду;

не должны иметь другого природного резервуара, кроме организма человека и животных;

после выделения из организма в окружающей среде они должны сохранять жизнеспособность в сроки, близкие к срокам выживания патогенных, выводимых из организма таким же путем;

не должны размножаться в окружающей среде;

не должны сколько-нибудь изменять свои биологические свойства в окружающей среде;

должны иметь типичные свойства для облегчения их дифференциальной диагностики;

индикация, идентификация и количественный учет должны производиться современными, простыми, легко доступными и экономичными микробиологическими методами.

2.3 Санитарно-показательные микроорганизмы

Санитарно-показательные микроорганизмы, определяемые в объектах окружающей среды

Лабораторная работа 1. Правила ТБ при работе в бактериологической лаборатории. Санитарно-микробиологическое исследование объектов производства (оборудования инструментов, помещений пищевых и перерабатывающих производств, смывов с рук предметов обихода)

Цель - ознакомиться с методами бактериологического контроля оборудования, инвентаря и рук работников предприятия, научиться давать заключение об их соответствии санитарно-гигиеническим требованиям.

Санитарно-микробиологическое исследование оборудования

Для проведения исследований оборудования необходимо иметь:

1. Трафареты размером 1, 3 и 5 см 2 из нержавеющего металла. (Перед работой их смачивает спиртом, фламбируют и накладывают на поверхность исследуемого объекта).

2. Стерильные пробирки с 9 мл Н2О и находящимися в них ватными тампонами, закрепленными на стержнях (стержнем вверх).

Определение общей микробной обсемененности (КМАФАнМ)

Ход работы. Стерильным тампоном протирают поверхность оборудования, ограниченную трафаретом, и погружает тампоны в ту же пробирку с 9 мл воды, получают разведение 1:10 и далее.(разведение 1:10).

Пробу с поверхностей рук берут тампоном, тщательно протирая ладонь, пальцы, пространство между пальцами и под ногтями, и помещают тампоны в пробирку (разведение 1:10).

При необходимости готовят следующие разведения 1:102, 1:103 и так далее. Для определения общего количества микроорганизмов глубинным методом 0,1 мл суспензии переносят в стерильную чашку Петри и заливают охлажденным до 45°С МПА. Инкубируют при 37°С 48 часов.

Учет. По истечении указанного срока число выросших колоний умножают на разведение, из которого сделан посев, и судят о степени загрязненности объекта (клеток микроорганизмов на поверхности I, 3, 5 см 2

Свежее фекальное загрязнение устанавливают, определяя наличие БГКП (преимущественно E.coli) на лактозной среде с добавлением борной кислоты, предварительно разлитой в пробирки и прогретой на водяной бане до 43-45°С.

Тампоны, которыми производили смыв с поверхности рук, помешают в эти пробирки, инкубация при 43°С продолжается 24 часа.

Учет. Помутнение среды и появление пузырьков газа -показатель присутствия бактерий группы кишечной палочки БГКП, преимущественно E.coli.

В смывах с рук не должны присутствовать БГКП, E.coli.

При оценке санитарно-гигиенического состояния предметов обихода и оборудования можно ориентироваться на категории, разработанные Л.В. Григорьевой и др. (табл. 1).

Таблица 1 - Критерии оценки по санитарно-микробиологическим тестам предметов обихода и оборудования

Модуль 3. Микробиология пищевых продуктов, сырья растительного и животного происхождения, кормов и кормовых добавок

3.1 Санитарно-микробиологисческий анализ молока и молочных продуктов

Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов проводится:

при систематическом плановом контроле соответствия качества продуктов, сырья требованиям НД;

по эпидемическим показаниям при расшифровке случаев инфекционных заболеваний, пищевых токсикоинфекций для выявления возбудителя, обнаружения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (их токсинов);

по специальным показаниям в случаях порчи сырья или приготовленных продуктов.

Микроорганизмы, свидетельствующие о санитарном неблагополучии:

КМАФАнМ определяется у тех продуктов, в технологии которых исключено применение специфической флоры;

Титр БГКП (для молока и молочных продуктов на среде Кесслера, для мяса и мясных продуктов - Хейфица);

Бактерии р.Proteus;

Энтерококки;

С. рerfringens.

На отбор проб продуктов и сырья имеются соответствующие ГОСТы.

Выделение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов из пищевых продуктов для установления возбудителей пищевых токсикоинфекций проводят при расшифровке вспышки инфекций, выяснения источника загрязнения: энтеротоксигенные стафилококки, энтерококки, эшерихии, Вас. сereus, C. Botulinum, C. Perfringens, V. parahaemolyticus.

Таблица 2 - Засеваемые разведения при определении КМАФАнМ

Глубинный посев на чашки Петри с МПА. Инкубация 48 час.

Нормы КМАФАнМ

КОЕ в 1 (г)мл молока пастеризованного не более 50 000-100 000

фляжного не более 200 000

мороженом 100 000

масле сливочном 10 000.

на производстве (при проверке эффективности пастеризации) не более 10 000 в 1мл молока.

Детские молочные смеси (сухие):не более 50 000 в 1 г

В кефире, простокваше, сметане, твороге, сырках и т.п. КМАФАнМ не определяют.

3.2 Санитарно-микробиологический анализ мяса и мясных продуктов

1. Пути и источники обсеменения мяса микроорганизмами (эндогенный и экзогенный пути обсеменения)

2.Санитарно- микробиологическое исследование мяса и мясных продуктов проводят:

- при предположении обсеменения мяса возбудителями зооантропозов или пищевых токсикоинфекций и токсикозов;

- плановое при контроле гигиенического состояния производства мясных продуктов;

- по требованию ветеринарной или санитарной службы на присутствие патогенной или условно-патогенной микрофлоры;

- по эпидемическим показаниям при выяснении причин заболевания людей, употребивших в пищу мясные продукты.

Определяемые показатели: КМАФАнМ, БГКП, р. Salmonella, бактерии р. Proteus, коагулазоположительные стафилококки, C. рerfringens. Они отражают качество обработки мясопродуктов и соблюдение санитарного режима при транспортировке и хранении.

Определение общей обсемененности (ориентировочно) можно провести методом мазков-отпечатков; КМАФАнМ в 1 г (мл) продукта - методом глубинного посева на плотную питательную среду МПА.

Определение титра БГКП проводят на среде Хейфица, из разведений, инкубация 18-20 час при 43?С. Далее по схеме ставят бродильные пробы.

Выделение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, втом числе сальмонелл: 5 г продукта засевают в 100 мл хлористо-магниевой среды, инкубируют при 37?С 16-24 часа. Выросшие на среде Эндо бесцветные колонии высевают на трехсахарный агар Олькеницкого. Идентифицируют по биохимическим и антигенным свойствам.

Обнаружение протея:. 0,5 мл суспензии высевают в конденсационную влагу свежескошенного МПА по методу Шукевича. Инкубируют 18-24 часа при 37?С. Отмечают ползучий, поднимающийся вверх по агару вуалеобразный рост. При микроскопии - грамотрицательные, подвижные палочки (перетрихи).

Показанием к исследованию является гнилостный запах, свидетельствующий о разложении продукта.

Определение клостридий: по 1 мл суспензии продукта засевают в две пробирки со средой Китта-Тароцци (для накопления). Одну из них помещают в водяную баню на 20 минут при 80?С, инкубируют 24-48 часов при 37?С. При наличии роста (помутнение среды, образование газа) пересевают на среду Вильсона-Блера (расплавленную и охлажденную до 45?С). Появление черных колоний в толще среды в течение 3-4 часов (или 24-48 час.) свидетельствует о присутствии анаэробов в исследуемом продукте.

3.3 Санитарно-микробиологический анализ рыбы и рыбных продуктов

Мышечная ткань рыбы в норме не содержит микрофлоры. Контаминация начинается после улова. На поверхности чешуи и жабрах свежeвыловленной рыбы обнаруживаются микроорганизмы родов Pseudomonas, Vibrio (V. parachaemolyticus, V.alginolyticus), причем преимущественно психрофильными. В очень загрязненных водоемах в выловленной рыбе можно обнаружить эшерихии, сальмонеллы, шигеллы, протеи, и другие из сем. Enterobacteriaceae. При чистке, кулинарной обработке поверхность тканей обсеменяется: микроорганизмами поверхности чешуи, кишечника, жабер. Кроме того, при повреждении при ловле крючком микроорганизмы могут попадать в кровь и распространяться по всему организму.

Наиболее опасно заражение возбудителями ботулизма (при употреблении вяленой и копченой рыбы). А при обсеменении рыбной продукции сальмонеллами, клостридиями перфрингенс, протеями, энтеротоксигенными штаммами стафилококков возможно возникновение токсикоинфекций.

Пищевые токсикоинфекции, могут вызываться галофильными вибрионами V. parachaemolyticus, широко распространенными в морской воде, при обсеменении рыбы, крабов, моллюсков.

Санитарно-микробиологический анализ проводят:

- как текущий контроль за санитарным состоянием производства;

- при санитарной экспертизе качества продукции;

- при расследовании случаев пищевых отравлений, связанных с употреблением рыбных продуктов

Отбор проб проводят по ГОСТу.

Используемые показатели:

- КМАФАнМ - определяют глубинным посевом на МПА 1-го мл суспензии мышечной ткани из разведений 1:10, 1:100;

- БГКП на среде Кесслера (100 мл 10% суспензии засевают в 50 мл среды), и далее по соответствующему ГОСТу

- стафилококки, протей, сальмонеллы, шигеллы, клостридии по соответствующим определяют по эпидемическим показаниям.

3.4 Микробиологический контроль биологически активных препаратов и их производства

Сырье животного происхождения, получаемое при убое сельскохозяйственных животных на мясокомбинатах, является основным исходным материалом для приготовления биологически активных препаратов (гормональных и ферментных) и используют для производства биологически активных препаратов - гормонов (гормональные препараты), ферментов (ферментные препараты) и других биологически активных веществ.

Используют следующие виды сырья:

· эндокринное -- гипофиз, паращитовидная железа, щитовидная железа, поджелудочная железа, надпочечники, половые железы, плацента;

· ферментное -- пилорическая часть желудка свиней, слизистая оболочка сычугов крупного и мелкого рогатого скота, поджелудочная железа, слизистая оболочка тонкого отдела кишечника;

· специальное -- кровь, печень, желчь, спинной мозг и др.

Это сырье нестерильно, в нем могут содержаться гнилостные бактерии, плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты, кокковая микрофлора и др. Загрязнение сырья сапрофитными и патогенными микробами происходит следующими путями: эндогенным (в результате прижизненного обсеменения, когда животное переболело или болеет какой-либо инфекционной болезнью, при переутомлении, переохлаждении, голоданиии др.); экзогенным (вследствие попадания в них микробов из внешней среды, при обескровливании животного, снятии шкуры, разделке, транспортировке и хранении туши, при убое животного с оборудования, кожного покрова, из желудочно-кишечного тракта, с рук рабочих и т.д.).

Лабораторная работа №2. Сравнительный анализ сырого и пастеризованного молока на основе микробиологического исследования

Цель - ознакомиться с бактериологическими методами исследования и научиться на основании полученных результатов давать оценку качества молока.

Исследование молока проводится в плановом порядке при:

1) внутризаводском контроле по ходу технологического процесса;

2) выпуске продукции с предприятия перерабатывающего молоко;

3) контроле соблюдения правил хранения и реализации;

4) по эпидемическим показаниям.

Задание 1. В предлагаемых образцах (пробах) молока №1 и 2 -определить:

общее количество микроорганизмов;

коли-титр;

количество молочнокислых бактерий;

наличие маслянокислых бактерий.

2. Познакомиться с косвенным методом определения общего количества микроорганизмов (проба на редуктазу):

- с метиленовым синим;

- резазурином.

Отбор проб молока или сливок осуществляется стерильным пробоотборником или черпаком в стерильную колбу с пробкой по 50 мл каждого. Допускается хранение пробы при температуре 5-6 о С до 4 часов с момента отбора.

Определение общего количества микроорганизмов

Ход работы. В основу количественного учета микроорганизмов, содержащихся в молоке, для оценки его качества положен метод предельных (последовательных) разведении. Для этого из колбы с 50 мл исследуемой пробы I мл стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды и готовят следующие разведения 1:10, 1:100, 1:1000 - для пастеризованного молока, 1:10, 1:100, 1:1000; 1:10000. 1:100000 - сырого.

Из каждого разведения по I мл стерильной пипеткой переносят в стерильную чашку Петри (рис. 2), заливают расплавленным и охлажденным до 45°С МПА аккуратно, покачивая чашку для равномерного распределения посевного материала, перемешивают. Инкубируют при температуре 37°С двое суток.

Рис. 2 - Схема посева разведений в чашки Петри

образец 1 - пастеризованное молоко из 3-х разведений;

образец 2 - сырое молоко из 5-ти разведений.

Учет. Для работы отбирают чашки, на которых вырастает от 50 до 250 колоний. Количество колоний подсчитывают на темном фоне. Число колоний, выросших на каждой чашке, умножают на соответствующее разведение, из которого сделан посев. При параллельном высеве в нескольких чашках подсчитывают среднее арифметическое.

Количественный учет молочнокислых бактерий чашечным методом

Количественный учет молочнокислых бактерий проводят по аналогии с выше описанным.

Из каждого разведения по 1 мл суспензии переносят стерильной пипеткой в стерильную чашку Петри и заливают расплавленной и охлажденной агаризованной капустной средой для молочнокислым бактерий с мелом. Инкубируют при температуре 30°С 72 часа.

Учет. Колонии молочнокислых бактерий распознают по зонам просветления, которые образуются в результате растворения мела молочной кислотой, продуцируемой этими микроорганизмами. Подсчитывают КОЕ молочнокислых бактерий в I мл молока.

Определение коли-титра молока

Коли-титр - наименьшее количество исследуемого продукта, в котором устанавливается наличие кишечной палочки (Escherichiacoli).

Коли-титр характеризует санитарно-гигиенический режим получения и обработки молока, условия содержания лактирующих коров.

В молоке и сливках определяют бродильньй титр - наименьшее количество, в котором присутствует хотя бы одна клетка бактерий группы кишечной палочки (БГКП). Титр кишечной палочки определяется методом бродильных проб.

Первая бродильная проба: в шесть пробирок со средой Кесслера засевают молоко: в три по 1 мл; в три по 0,1 мл.

Учет. Просматривают пробирки. Пузырьки газа свидетельствуют о возможном загрязнении молока E.coli. Для подтверждения ставят вторую бродильную пробу.

Вторая бродильная проба: из пробирок, в которых обнаружены пузырьки газа, делают посев бактериологической петлей в чашку Петри с элективной средой Эндо.

Посев инкубируют при температуре 37°С 18-24 час.

Учет. При обнаружении на среде Эндо красных с металлическим блеском или розовых слизистых колоний их изучают выборочно (окрашивают по Граму, ставят оксидазный тест) и для грамотрицательных и оксидазоотрицательных палочек ставят третью бродильную пробу с глюкозой.

Коли-титр пастеризованного молока и сливок устанавливают следующим образом (табл. 3):

Коли-титр более 3 - ни в одной пробирке нет газообразования;

Коли-титр равен 3 - в одной из трех пробирок, засеянных I мл молока есть газообразование;

Коли-титр равен 0,3 - брожение обнаружено более чем в одной пробирке с 1 мл или хотя бы в одной из пробирок с 0,1 молока.

Таблица 3 - Определение коли-титра

	Наличие кишечной палочки в 1 мл продукта	Коли-титр

Примечание: (+) - E.coli присутствует

(-) - E.coli отсутствует

Определение титра маслянокислых бактерий

Из каждого разведения исследуемого образца молока по I мл засевают в пробирки со стерильным молоком (в качестве питательной среды). Засеянные пробирки нагревают в водяной бане при температуре 85°С в течение 10 мин.

Инкубирует в термостате при температуре 30°С 3 дня (72 часа).

Учет. Наличие маслянокислых бактерий определяют по образованию газа, запаху масляной кислоты. Из таких пробирок готовят мазок "раздавленная капля". На предметное стекло помещают I каплю содержимого исследуемой пробирки, добавляют раствор Люголя (раствор йода в йодистом калие) накрывает покровным стеклом, микроскопируют с масляной иммерсией.

Маслянокислые бактерии - это подвижные, спорообразующие, неправильной формы клетки (клостридии или плектридии), в которых гранулеза - запасное питательное вещество - окрашивается раствором йода в йодистом калии в фиолетовый цвет.

Титром маслянокислых бактерий считают то наибольшее разведение молока, в котором обнаруживается рост маслянокислых бактерий.

Результаты исследований оформляют в таблице 4 и делают вывод о микроорганизмах, содержащихся в сыром и пастеризованном молоке.

Таблица 4 - Сравнительный анализ качества исследованных образцов молока

Задание 2. Определение общего количества бактерий в молоке косвенным методом

В основе метода лежит способность бактерий выделять редуктазу (восстанавливающую метиленовый синий или резазурин). 0бесцвечивание метиленового синего, или резазурина наступает тем быстрее, чем больше микробов в молоке.

Проба с метиленовым синим. К 20 мл молока прибавляют I мл метиленового синего и помещают после перемешивания в водяную баню при 38°С на 5,5 часов (первые 20 минут наблюдают пробирки непрерывно, затем через 2 и 5,5 ч.). Оценивают по таблице 5.

Таблица 5 -Оценка качества молока в зависимости от результатов пробы на редуктазу

Продолжительность реакции, час ГОСТ 9225-84	Окраска молока ГОСТ 9225-84	в I мл молока
с метиленовым синим	с резазурином	с метиленовым синим	с резазурином
				До 300 тыс.
Более 3,5 ч		Обесцве-чивание	Сине-стальная	300- 500 тыс.
		Обесцве-чивание	Сиреневая или сине-фиолетовая	От 500 тыс.
		Обесцве-чивание	Розовая или белая	От 4 млн до 20 млн
20 мин и <		Обесцве-чивание			Очень плохое

Лабораторная работа №3. Микробиологический контроль качества лабораторных заквасок

Цель - ознакомление со схемой контроля качества заквасок

Для приготовления молочнокислых продуктов используют закваски, состоящие из чистых культур молочнокислых стрептококков (табл. 6) и молочнокислых палочек (табл. 7).

Высококачественные закваски характеризуются:

Отсутствием посторонней микрофлоры;

Активностью закваски, которая определяется по времени сквашивания молока;

Способностью образовывать диацетил и ацетоин, которые создают аромат молочнокислых продуктов;

Способностью продуцировать СО2.

Анализу подвергаются жидкие и сухие закваски, из которых готовят фиксированные препараты, окрашивают метиленовым синим 3-5 минут. При микроскопии просматривают 10 полей зрения. В препарате закваски хорошего качества отсутствуют скопления клеток молочнокислых бактерий и посторонние микроорганизмы.

Посторонней микрофлорой для заквасок являются: БГКП (E.coli), спорообразующие аэробные и анаэробные бактерии, дрожжи, микроскопические грибы. При обнаружении в микроскопических препаратах посторонней микрофлоры, последнюю идентифицируют в следующем порядке:

I. 3 мл закваски переносят в 20 мл среды Кесслера для определения коли-титра по схеме, описанной в лабораторной работе 1

2. Для определения наличия спорообразующих бактерий по I мл закваски помещают в 2 пробирки с 20 мл стерильного молока и одну из пробирок заливают слоем парафина. Обе пробирки выдерживают в водяной бане при 85°С 10 минут. Затем культивируют в термостате при 30°С двое суток.

Учет. В присутствии анаэробных спорообразующих бактерий парафиновая пробка поднимается, молоко пептонизируется. Из содержимого пробирок готовят препараты, окрашивают метиленовым синим 3-5 минут и при микроскопии обнаруживают спорообразующие палочки.

3. Дрожжи и микроскопические грибы определяют высевом на чашки Петри с сусло-агаром.

Таблица 6 - Характеристика молочнокислых стрептококков

Стрептококки	Морфология		Температура, оС	Предельная кислотность, оТ	Характер сгустка		Консистенция
			Оптимальная	Предельная
Streptococcus lactis	Диплококки, короткие палочки	Каплевидная блестящая, беловатая, 1-2 мм			120			Колющаяся
Streptococcus cremoris					110-115			Сметанообразная
Streptococcus diacetilactis						Ровный, плотный иногда рваный	Слабокислый	Колющаяся
Streptococcus thermophilus						Ровный, плотный	Слабокислый	Колющаяся

Таблица 7 - Характеристика молочнокислых палочек

Молочнокислые палочки	Морфология		Температура, оС	Предельная кислотность, оС
			оптимальная	предельная
Lactobacillus bulgaricus	Крупные палочки с закругленными концами, часто в виде цепочек 2-20 мкм	Поверхностные - волнистые; глубинные - в виде кусочков ваты
Lactobacillus acidophilus	Палочки различной длины, одиночные или в виде цепочек 1,5-6 мкм	Мелкие, гладкие, бесцветные
Lactobacillus casei	Палочки разной длины в виде отдельных и двойных клеток	Поверхностные - круглые; глубинные - лодочковидные, иногда с выростом

Активность закваски определяется временем свертывания пастеризованного или кипяченого молока при внесении в него 5% закваски: I мл (г) закваски вносят в 20 мл молока.

Время свертывания молока закваской хорошего качества:

не более 6 часов - для молочнокислых палочек;

не более 7 часов - для молочнокислых стрептококков.

Определение ацетоина и диацетила

Закваску фильтруют. В фарфоровую чашку вносят 3 капли фильтрата и 3 капли 40% раствора КОН. Появление розового окрашивания через 10-15 минут свидетельствуем о наличии ацетоина и диацетила. Окрашивание через 30 минут не учитывается, если в закваске есть E.coli, метод не эффективен.

Определение СО2.

Пробирку с 2 мл хорошо перемешанной закваски, предварительно сделав отметку уровня закваски в пробирке, помещают в баню с холодной водой и нагревают воду в бане до 90°С. Не вынимая пробирки и отмечают уровень поднятия сгустка.

Если в закваске есть СО2, сгусток становится рубчатым и поднимается над сывороткой на 0,6-3,0 см и больше - указывается на присутствие в закваске Streptococcus diacetilactis, Streptococcus paracitovorus.

Лабораторная работа №4. Микробиологическое исследование кисломолочных продуктов

Цель - изучить микрофлору кисломолочных продуктов и оценить их качество.

Исследование кисломолочных продуктов, приготовленных на заквасках мезофильных молочнокислых бактерий.

Обыкновенная простокваша. Готовая простокваша имеет ровный сгусток слабокислый вкус , добавлен 06.08.2015

Характеристика основных показателей микрофлоры почвы, воды, воздуха, тела человека и растительного сырья. Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе. Влияние факторов окружающей среды на микроорганизмы. Цели и задачи санитарной микробиологии.

реферат , добавлен 12.06.2011

История развития микробиологии как науки о строении, биологии, экологии микробов. Науки, входящие в комплекс микробиологии, классификация бактерий как живых организмов. Принцип вакцинации, методы, повышающие резистентность человека к микроорганизмам.

презентация , добавлен 18.04.2019

Предмет, задачи и этапы развития микробиологии, ее значение для врача. Систематика и номенклатура микроорганизма. Механизмы резистентности бактерий к антибиотикам. Генетика бактерий, учение об инфекции и иммунитете. Общая характеристика антигенов.

курс лекций , добавлен 01.09.2013

Закономерности количественного и качественного содержания микроорганизмов в пресных водоемах от различных факторов. Поступление патогенных микроорганизмов воду и их выживаемость в водной среде. Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах.

курсовая работа , добавлен 28.11.2011

Морфология, классификация и физиология микроорганизмов, распространение в природе, влияние условий внешней среды на их развитие. Пищевые отравления бактериального и немикробного происхождения и их профилактика. Микробиология важнейших пищевых продуктов.

методичка , добавлен 27.01.2013

шпаргалка , добавлен 13.01.2012

История развития микробиологии, задачи и связь с другими науками. Роль микробов в народном хозяйстве и патологии животных. Изучение плесеней и дрожжей. Микрофлора животных, почвы и кормов. Понятие и значение антибиотиков, стерилизации и пастеризации.

шпаргалка , добавлен 04.05.2014

Понятие, цель и задачи клинической микробиологии. Клинико-лабораторная диагностика, специфическая профилактика и химиотерапия инфекционных болезней, часто встречающихся в широкой медицинской практике в неинфекционных клиниках. Дезинфекция. Стерилизация.

презентация , добавлен 22.11.2016

Понятие микробиологии как науки, ее сущность, предмет и методы исследования, основные цели и задачи, история зарождения и развития. Общая характеристика микроорганизмов, их классификация и разновидности, особенности строения и практическое использование.